Innanzitutto, un campione di tessuto viene raccolto e conservato, rilevando la sua posizione geografica e l'ambiente locale.
Un disco di una piccola foglia, un insetto intero, o un campione di muscolo sono fonti adeguate.
Il DNA viene estratto dal campione di tessuto, e la porzione di codice a barre del gene Rbcl o Cox1 viene amplificata mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR). La sequenza amplificata (amplicone) e' sottoposta a sequenziamento in una o in entrambe le direzioni.

I risultati del sequenziamento sono poi utilizzati per la ricerca nei database di DNA. Una stretta corrispondenza tra la sequenza di basi del campione e una sequenza presente nel database identifica rapidamente una specie gia' catalogata. Potrebbe accadere che alcuni codici a barre siano del tutto nuovi e l'identificazione puo' portare all'immissione delle specie sconosciute in un albero filogenetico. I nuovi codici a barre saranno inviati alla banca dati Barcode of Life DataBank presso l'Universita' di Guelph per la validazione.

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protocollo estrazione e pcr DNA animale

protocollo estrazione e pcr DNA vegetale

protocollo elettroforesi del DNA

per esercitarsi con il sito DNA Subway provate ad identificare la specie vegetali utilizzando le seguenti sequenze:
sequenza 1
sequenza 2

 

PIANIFICAZIONE E PREPARAZIONE DELL'ESPERIMENTO

Come prima fase del lavoro, si consiglia di discutere in classe per identificare un progetto e organizzare di conseguenza la raccolta dei campioni.
Una delle applicazioni del DNA barcode e' quella del monitoraggio delle specie di un determinato habitat o area.

Dal momento che e' impossibile prendere in considerazione tutti gli animali e le piante di un dato luogo, si devono raccogliere dei campioni che siano rappresentativi di quel determinato luogo. Per esempio, si possono raccogliere campioni di tutte le piante e gli animali presenti su un mq di terreno, Questo metodo di campionamento consente di confrontare la biodiversita' di diversi habitat.
E' opportuno usare dei retini per raccogliere insetti o invertebrati acquatici.
Per fare un campionamento di acqua dolce, si puo' raccogliere (per filtrazione o centrifugazione) tutto il materiale biologico contenuto in un dato volume di acqua.
Piante
Evitare di raccogliere parti legnose, difficili da frantumare, e tessuti di riserva ricchi di amidi (radici e tuberi) perche' contengono metaboliti che possono interferire con la estrazione del DNA e la reazione di PCR. Se non sono disponibili piante verdi, e' possibile isolare il DNA da materiale secco o congelato. Si possono utilizzare anche prodotti del supermercato, di erboristerie o affini. I prodotti freschi vanno bene, ma e' possibile partire anche da cibi processati. E' piu' difficile estrarre il DNA da materiale grasso e oleoso.
Animali
Gli insetti sono organismi ideali per il barcoding. Per la cattura degli insetti si puo' utilizzare un barattolo a bocca larga con un buon tappo di chiusura. Mettere sul fondo del barattolo dei dischi di carta assorbente (spessore 1cm) intrisi di acetone (quello usato per togliere lo smalto sulle unghie). Tenere il barattolo ben chiuso e lontano da fiamme. In alternativa, gli insetti catturati possono essere messi in freezer per almeno 1 ora.
Nel caso di animali piu' grandi, Il DNA puo' essere estratto da peli, piume o escrementi. I follicoli piliferi e I tessuti ricavati grattando la base di una piuma sono buone fonti di DNA.
Campioni di carne (rossa o bianca) o di pesce del supermercato sono buone fonti di DNA, sia freschi che congelati, cosi come molti cibi pronti. Il sangue e il midollo osseo sono tesssuti adatti, non le ossa e la pelle.
Fatta eccezione per il pesce, non prelevate campioni da vertebrati. Fate attenzione nel campionamento di animali trovati morti sulla strada ed evitate gli escrementi di animali che sono vettori di malattie.

RACCOLTA, DOCUMENTAZIONE E IDENTIFICAZIONE DEI CAMPIONI
Lavorate con buon senso: chiedete i dovuti permessi se volete raccogliere campioni in terreno privato.
Rispettate l'ambiente e gli habitat protetti. Raccogliete solo il quantitativo di materiale necessario per eseguire il barcoding.
Non raccogliete campioni che possano appartenere a specie protette o a rischio di estinzione.
Siate consapevoli del fatto che potreste trovare specie tossiche o velenose.
Consultatevi con il vostro insegnante prima di eseguire un prelievo se avete dubbi sulla tossicita' o su altre questioni.
Considerate anche che parte del prelievo deve essere utilizzato per studi di tassonomia classica e come campione di riferimento, in caso vogliate inserire il vostro risultato nella banca dati BOLD.

MATERIALI
Ogni squadra deve essere dotata di provette, barattoli, sacchetti di plastica sigillabili, pinzette, un bisturi, forbici, un telefonino provvisto di macchina fotografica o macchina fotografica digitale con GPS.
E' utile anche un atlante da campo con i principali criteri tassonomici per animali e piante. Le guide tassonomiche regionali sono disponibili in rete, nelle biblioteche o nei musei di storia naturale o negli orti botanici.